Некоторое время после окончания института  работал по распределению в воинской части (вуз был военным). Компьютеры в Советском Союзе были большой редкостью, но Касперскому повезло: первый ЭВМ в организации вскоре достался ему. Интересоваться компьютерными вирусами Евгений начал после того, как в 1989 году обнаружил один из них на своей машине. С тех пор у Касперского появилось своеобразное хобби: он стал коллекционировать вирусы и искать способы защиты от них.

В 1991 году Касперский уволился из армии и стал заниматься вирусами вплотную. «Лечением» заражённых компьютеров он подрабатывал ещё в армии. Тогда же он начал работать в НТЦ«Ками». Вскоре к нему присоединились несколько единомышленников, а в 1994 разработчики заняли первое место на сравнительных тестах в Германии. На специалистов сразу же обратили внимание зарубежные компании. Антивирусный проект «AVP» постепенно развивался. В работе Касперскому помогала его жена Наталья. Как признаётся сам Касперский, таланта предпринимателя у него не было, поэтому всеми деловыми вопросами занималась супруга. В 1997 году была основана антивирусная «Лаборатория Касперского».

В настоящее время Евгений Валентинович Касперский является одним из ведущих специалистов в области защиты от вирусов на планете, автором множества статей и книг по компьютерной вирусологии. Он часто выступает на специализированных конференциях в России и за границей. Евгений Касперский является членом Организации исследователей компьютерных вирусов (CARO), объединяющей лучших экспертов в этой области. В свободное время, которого у него не слишком много, Касперский предпочитает путешествовать.

Компания Касперского имеет более 100 партнеров и более 1500 крупных корпоративных клиентов только в странах СНГ. Она имеет свои представительства в Великобритании и США. Специалисты «Лаборатории Касперского» планируют в течение ближайших пяти лет стать одним из ведущих поставщиков антивирусного программного обеспечения на планете. В России антивирусные программы «Лаборатории» («Антивирус Касперского», «KasperskyInternetSecurity» и другие) по праву считаются одними из лучших и самыми распространёнными среди пользователей ПК.